• Development of molecular methods for detection and epidemiological investigation of HIV-1, HIV-2, and HTLV-I/II infections

      Meijer A; Borleffs JCC; Roosendaal G; Loon AM van; VIR; AZU; Van Creveld Kliniek Utrecht (Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu RIVM, 1995-01-31)
      The work presented here was initiated to determine the possibilities of molecular methods for the detection and epidemiological investigation of HIV and HTLV infections. We present the results of a literature research and describe the development and partial evaluation of a new PCR method for the amplification of RNA and DNA sequences of the HIV-1 pol, env and gag, HIV-2 ltr and HTLV-I/II tax/rex genes. For the amplification of viral RNA, samples were treated with guanidium thiocyanate and sodium lauryl sarcosinate to disrupt the virus and to inactivate RNAses. Paramagnetic beads were used to extract the RNA, followed by solid-phase reverse transcription for cDNA synthesis. DNA or cDNA was amplified using a two-step PCR protocol in which the product from the first PCR was further amplified in a second PCR with nested primers combined with a touch-down temperature protocol to enhance sensitivity and specificity. A pilot study showed that in all peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples from seven HIV-1-infected individuals of CDC class II, proviral HIV-1 DNA was detected using three primer sets. HIV-1 RNA could be detected in the plasma from ten of fifteen HIV-1-infected individuals of CDC class II. Together with data from the literature, our results indicate that PCR methods are useful in the detection of HIV-1 infections and complementary to conventional methods such as enzyme immunoassays and Westernblot. They are especially useful when conventional methods do not allow a diagnosis to be made, for example in newborns of HIV-infected mothers, in monitoring of the viral load, and in patients with idiopathic CD4+ T-lymphocytopenia. Using the same method, we amplified HIV-2 and HTLV-I RNA and DNA sequences. However, clinical evaluation of these PCR methods must be conducted. This newly developed method may possibly be used in molecular epidemiological studies as we were able to directly sequence the product of the HIV-1 env np-PCR, the V3 variable region of the gp120 gene. However, molecular epidemiology must be conducted at the clonal level with more than one isolated part of the viral genome. For molecular epidemiological studies of HIV-1, for example, the variable regions V3, V4, and V5 of the gp120 gene together are useful targets. Promising methods for obtaining materials for PCR as well as serology with regard to epidemiology on the streets are the use of finger-prick blood spots on filter paper and saliva collection. Further studies are needed to determine the value of these methods in molecular epidemiological investigation.
    • Development of molecular methods for detection and epidemiological investigation of HIV-1, HIV-2, and HTLV-I/II infections

      Meijer A; Borleffs JCC; Roosendaal G; van Loon AM; VIR; AZU; Van Creveld Kliniek Utrecht (Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu RIVM, 1995-01-31)
      Het onderzoek dat hier wordt gepresenteerd werd gestart om de mogelijkheden van moleculaire methoden voor detectie en epidemiologisch onderzoek van HIV en HTLV infecties te onderzoeken. We presenteren de resultaten van een literatuurstudie en beschrijven de ontwikkeling en gedeeltelijke evaluatie van een PCR methode voor de amplificatie van RNA en DNA sequenties van HIV-1 pol, env en gag, HIV-2 ltr en HTLV-I/II tax/rex genen. Voor de amplificatie van viraal RNA werden de monsters behandeld met guanidine thiocyanaat en natrium-lauryl-sarcosinaat om het virus kapot te maken en om RNAses te inactiveren. Paramagnetische bolletjes werden gebruikt om het RNA te extraheren gevolgd door solid-phase reverse-transcriptie voor cDNA synthese. Een twee-staps PCR protocol werd gebruikt voor de amplificatie van DNA of cDNA, waarbij het produkt van de eerste PCR verder wordt geamplificeerd in een tweede PCR met nested primers gecombineerd met een touch-down temperatuur protocol, om de gevoeligheid en specificiteit te verhogen. Een pilotstudie laat zien dat in alle perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters van zeven HIV-1 geinfecteerde individuen uit CDC klasse II, proviraal HIV-1 detecteerbaar was gebruik makend van drie primersets. HIV-1 RNA was detecteerbaar in plasma van 10 van vijftien HIV-1 geinfecteerde individuen uit CDC klasse II. Samen met gegevens uit de literatuur geven onze resultaten een indicatie dat PCR methoden bruikbaar zijn voor detectie van HIV infecties als toegevoegde methode aan de conventionele methoden zoals de enzym-immunoassays en de westernblot. Ze zijn speciaal geschikt als met de conventionele methoden geen duidelijke diagnose gesteld kan worden, zoals bijvoorbeeld bij borelingen van HIV geInfecteerde moeders, bij het volgen van de hoeveelheid aanwezig virus en bij patienten met een idiopatische CD4+ T-lymfocytopenie. Met dezelfde methode zijn HIV-2 en HTLV-I RNA en DNA sequenties geamplificeerd. Echter, deze methoden moeten nog klinisch geevalueerd worden. Deze nieuw ontwikkelde methode is mogelijk bruikbaar voor moleculair epidemiologische studies omdat het produkt van de HIV-1 env np-PCR, het V3 variabele gebied van glycoproteine gp120 gen, direct te sequencen was. Echter, moleculaire epidemiologie moet uitgevoerd worden op het nivo van moleculaire kloons van het virus in meer dan een gebied van het virale genoom. Voor moleculair epidemiologische studies van HIV-1 zijn, bijvoorbeeld, de variabele gebieden V3, V4 en V5 van het gp120 gen geschikte kandidaten. Veelbelovende methoden om materialen voor PCR en serologie bij epidemiologische veldstudies te verkrijgen zijn het gebruik van vingerprik-bloed op filter papier en van speeksel afname. Verdere studies zijn nodig om de waarde van deze methoden in moleculair epidemiologisch onderzoek vast te stellen.<br>