A comparison of ELISA methods for the determination of human serum antibodies to Haemophilus influenzae type b

Abstract

Een vergelijking tussen de non-competitieve ELISA van Phipps et al., de klassieke radio-antigeen bindings assay (RABA) en de nieuw ontwikkelde Chiron competitieve ELISA voor de bepaling van anti-Hib polysaccharide (HibPs) antistof concentraties in humane sera wordt beschreven in het rapport. Voor dit onderzoek werden 4 serum panels, alle afkomstig uit hetzelfde klinische veldonderzoek, gebruikt en de resultaten werden vergeleken met de originele veldonderzoek gegevens, bepaald m.b.v. Phipps' non-competitieve ELISA. Betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid plus een goede correlatie met de RABA tonen aan dat zowel de Chiron competitieve ELISA als de Phipps' non-competitieve ELISA de gevestigde RABA kunnen vervangen voor de bepaling van anti-HibPs totaal Ig. Het duidelijke voordeel van de enigszins meer bewerkelijke competitieve ELISA, zoals voorgesteld door Mariani et al., is echter dat overschatting van het percentage individuen met antistof titers > 0,15 mug/ml achterwege blijft in vergelijking met de non-competitieve ELISA. Competitie met vrij HibPs bleek noodzakelijk om vals positieve binding te voorkomen bij antistof concentraties ó 1,0 mug/ml. Hoewel het probleem mogelijk grotendeels beperkt blijft tot pre-immuun sera, kan het toch wel degelijk van invloed zijn op het aantal mensen dat ten onrechte als voldoende beschermd wordt beschouwd (tegen Hib). De Phipps' non-competitieve ELISA is te verbeteren door veranderingen in de incubatie tijd, incubatie temperatuur, incubatie buffers, conjugaat en type ELISA plaat in de richting van de Chiron competitieve ELISA toe te passen. Op basis van de resultaten introduceren we een verbeterde ELISA voor het bepalen van Hib antistoffen. Belangrijkste elementen zijn dat monsters worden getest in een tweevoudige verdunningsreeks en controle wells met vrij oplosbaar Haemophilus influenzae type b polysaccharide worden ingezet voor monsters met een Hib antistof concentraties ó 1,0 mug/ml.<br>

A comparison between the non-competitive ELISA from Phipps et al., the established radio-antigen binding assay (RABA) and the newly developed Chiron competitive ELISA for measuring anti-Hib polysaccharide (HibPs) antibody concentrations in human sera is described. For this study 4 different serum panels, all from the same clinical trial, were used and the results were compared with the original trial data, determined with the Phipps' non-competitive ELISA. Reliability, reproducibility plus a good correlation with the RABA demonstrate that both the Chiron competitive ELISA and the Phipps non-competitive ELISA can replace the classical RABA for anti-Hib total Ig determination. However, the clear advantage of the somewhat more laborious competitive ELISA, as proposed by Mariani et al., is that overestimation of the percentage of subjects with antibody titers > 0.15 mug/ml is absent, as compared to the non-competitive ELISA. Competition with free HibPs, appeared necessary to avoid false positive binding for anti Hib antibody concentrations 1.0 mug/ml. Although the problem might be restricted for a large part to pre-immune sera it can still influence the amount of subjects falsely considered sufficiently protected against Hib. The Phipps' non-competitive ELISA could be improved by changing the incubation time, incubation temperature , incubation buffers, conjugate and ELISA plate towards the conditions of the Chiron competitive ELISA. Based on the results we propose an improved ELISA for determining Hib antibodies. Basic elements are that samples are tested in a twofold serial dilution and control wells with free soluble Haemophilus influenzae type b polysaccharide are used for samples with Hib antibody concentrations ó 1.0 mug/ml.<br>