An investigation of the possibility to replace the rabbit pyrogen test by an in vitro test

Abstract

Voor veel parenteraal toe te dienen geneesmiddelen dient partijgewijs te worden aangetoond dat zij niet pyrogeen (koortsverwekkend) zijn. De meest voorkomende pyrogene verontreinigingen in biologische en biotechnologische geneesmiddelen zijn bacteriele toxinen. Met name endotoxinen afkomstig van Gram-negatieve bacterien zijn bekend om hun pyrogene eigenschappen. De klassieke test voor de detectie van pyrogene activititeit is gebaseerd op vergelijking van de rectale temperatuur van konijnen, voor en na toediening van een te testen substantie. Circa twintig jaar geleden is een in vitro test op bacterieel endotoxine ontwikkeld, die voor veel geneesmiddelen kan dienen als alternatief voor de pyrogenentest: de zogenaamde LAL-test (Limulus Amoebocyten Lysaat test). De LAL-test kent echter een aantal beperkingen, waardoor het niet voor alle parenterale geneesmiddelen geschikt is als alternatief voor de pyrogenentest. Onderzoek is verricht naar de mogelijkheid een alternatieve in vitro pyrogenentest te ontwikkelen, die is gebaseerd op de in vitro productie van cytokines (IL-6 en TNFalfa) door een humane monocyten cellijn (MonoMac-6). De resultaten van het onderzoek wezen er op dat voor een aantal bacteriele vaccins zowel de test op bacterieel endotoxine als de bepaling van cytokine-afgifte door humane monocyten een goed alternatief kunnen vormen voor de pyrogenentest in konijnen.

The classical test for the detection of pyrogenic contaminations in pharmaceuticals is the rabbit pyrogen test. The most frequently occuring and most important pyrogenic contamination in biological and biotechnological pharmaceutical preparations are bacterial endotoxins, originating from the cellular wall of Gram-negative bacteria. There is an alternative in vitro test for the detection of these bacterial endotoxins available, the so-called LAL-test. However, due to some drawbacks, e.g. interfering factors in some pharmaceuticals, this LAL-test cannot always be applied as a suitable alternative for the rabbit pyrogen test. Experiments were performed to determine the suitability of a so-called 'cytokine release test' as an alternative for the rabbit pyrogen test. Cells of the monocyte cell-line MonoMac-6 were incubated in the presence of several vaccines and blood products, and the cytokine (IL-6 and TNFalpha) release promoting activity of these vaccines and blood products was determined. The results of the cytokine release test were then compared with the results of both the LAL-test and the rabbit pyrogen test. Regarding some bacterial vaccines both the cytokine release test and the LAL-test are considered to be suitable alternatives for the rabbit pyrogen test.