Tijdens het EU-project 'Bacteriofagen in zwemwater' (januari 1996 - juni 1999) werd onderzoek uitgevoerd naar de ontwikkeling van referentie materialen voor de implementatie van methoden voor de bepaling van bacteriofagen in water. Verschillende partijen referentie materialen (RMs) met reincultures van fagen, alsmede ook natuurlijk besmette standaard monsters met mengsels van (natuurlijk voorkomende) fagen en achtergrond flora, werden bereid. Voor alle drie de typen bacteriofagen welke tijdens dit project van belang waren, werden homogene en stabiele referentie materialen met reincultures van fagen bereid: somatische colifagen (SOMCPH), F-specifieke RNA fagen (FRNAPH; welke het verschil is tussen het totaal aantal F-specifieke fagen (FTOTPH) en het aantal F-specifieke DNA fagen (FDNAPH)) en fagen van Bacteroides fragilis (BFRPH). De faag RMs werden bereid door faag suspensies met glycerol te mengen (tot een eindconcentratie van 5% v/v) waarna de materialen bij -70 graden C werden opgeslagen. De gebruikte standaard fagen waren: ?X174 voor SOMCPH, MS2 voor FRNAPH, B40-8 voor BFRPH met gastheer HSP40 en B56-1 voor BFRPH met gastheer RYC2056. De faag RMs hebben hun nut bewezen voor kwaliteitscontrole doeleinden door middel van bereiding van controlekaarten. De natuurlijk besmette standaard monsters werden bereid door rioolwater te mengen met pepton fysiologische zoutoplossing en glycerol. Deze materialen waren echter minder homogeen dan de RMs met faag reincultures. De standaard monsters waren minimaal 4 maanden stabiel bij opslag bij (-70 ong. 10) graden C en 1-2 maanden indien opgeslagen bij (-20 ong. 5) graden C. Bij temperaturen boven 0 graden C was de stabilitiet slecht.<br>

Als onderdeel van het EU-project 'Bacteriofagen in zwemwater' werd onderzoek uitgevoerd ter optimalisatie van de methode voor de detectie en enumeratie van somatische colifagen in water, zoals beschreven in ISO/CD 10705-2 van augustus 1995. Geconcludeerd werd dat deze concept ISO aangepast dient te worden op een aantal onderdelen. Het betreft onder andere de volgende aanpassingen. Voor het bepalen van het kiemgetal van de gastheer cultuur WG Escherichia coli dient membraanfiltratie of de gietplaat methode gebruikt te worden in plaats van de spreidplaat methode, daar deze laatste voorkeur dient een vers gekweekte inoculum cultuur van WG5 en geen ingevroren inoculum cultuur geruikt te worden, daar invriezen van de inoculum cultuur de faagtellingen negatief beinvloedt. Voor de faagbepaling heeft de Double Agar Layer methode (DAL) de voorkeur boven de Single Agar Layer methode (SAL), daar de DAL methode hogere resultaten heeft dan de SAL methode.<br>

Het Communautair Referentie Laboratorium voor Salmonella (CRL-Salmonella, Bilthoven, Nederland) organiseerde in samenwerking met Public Health Laboratory Service (PHLS), London, Verenigd Koninkrijk en het Central Institute for Animal Disease Control - Sectie Infectieziekten (CIDC, Lelystad, Nederland) een achtste ringonderzoek aangaande de typering van Salmonella. Zeventien Nationale Referentie Laboratoria voor Salmonella (NRLs-Salmonella) en 15 EnterNet Laboratoria (ENLs) namen deel aan deze studie. Drie van deze NRLs zijn eveneens ENL. De resultaten van deze drie NRL-ENL laboratoria werden alleen geevalueerd bij de 17 NRLs voor Salmonella. In totaal werden 20 stammen van het species Salmonella enterica subspecies enterica geselecteerd voor serotypering terwijl 10 stammen van Salmonella Typhimurium (STM) en 10 stammen van Salmonella Enteritidis (SE) werden geselecteerd voor faagtypering. In het algemeen waren er geen problemen met het typeren van de O-antigenen. Sommige laboratoria hadden problemen met het typeren van de H-antigenen. Bijna alle laboratoria hadden weinig problemen met het faag-typeren. Enige ENLs hadden problemen met het faagtyperen van de SE stammen. Tien stammen van verschillende Salmonella serotypen werden getest op hun resistentie patronen tegen een panel van 12 antibiotica door bijna alle laboratoria. De NRLs en ENLs waren vrij om te kiezen tussen de Minimale Inhibitie Concentratie (MIC) of de disc diffusie test. Meer dan 95% van alle testen werden goed uitgevoerd. De meeste problemen werden veroorzaakt door streptomycine.<br>

De achtste workshop, welke georganiseerd werd door het Communautair Referentie Laboratorium voor Salmonella (CRL-Salmonella), vond plaats van 14 tot en met 16 Mei 2003 in Bilthoven (Nederland). De afgevaardigden van de Nationale Referentie Laboratoria voor Salmonella (NRLs-Salmonella) van de Kandidaat Landen van de EU woonden de workshop bij op de 14e en 15e Mei 2003. De afgevaardigden van de NRLs-Salmonella van de EU namen deel aan de workshop op 15 en 16 mei. De candidate lidstaten presenteerden zichzelf door het houden van een presentatie over Salmonella onderzoek in hun eigen land. Presentaties over de vergroting van de EU en de zoonose richtlijn werden gehouden alsmede over de resultaten van twee ringonderzoeken, welke georganiseerd werden door het CRL-Salmonella. Op de derde dag van de workshop werden twee sessies georganiseerd getiteld: "Antibiotische resistentie" en "Standaardisatie van detectie methoden". Over beide onderwerpen werd door experts een introductie gehouden, waarna de inhoud van de presentaties in detail werd besproken. Vergelijking van data van antimicrobi6le resistentie bepalingen wordt belemmerd door het gebruik van verschillende methoden en interpretatie criteria. De discussie, welke gehouden werd over dit onderwerp, wees uit dat standaardisatie van test methoden en harmonisatie van internationale gegevens noodzakelijk is. Tevens werd besproken of een aparte methode voor de analyse van Salmonella in faeces beschreven zou moeten worden als een Annex bij de geldende ISO 6579: 2002.

Als onderdeel van een Europees project werd de methode voor de telling van Clostridium perfringens in voedingsmiddelen en diervoeders, zoals beschreven in ISO 7937 (1997) gevalideerd. Een ringonderzoek werd georganiseerd om de precisie, zijnde de herhaalbaarheid (r) en de reproduceerbaarheid (R), van deze methode te bepalen. Zeventien laboratoria in 13 Europese landen analyseerden kaas, vlees, gedroogd diervoeder en een referentiemateriaal volgens een standaard protocol. Alle monsters waren kunstmatig besmet om het gewenste besmettingsniveau (blanco, laag, midden en hoog) en homogeniteit te verkrijgen. De studie bevatte twee technieken voor de bevestiging van vermoedelijk Clostridium perfringens, zodat mogelijke verschillen in prestatie gedetecteerd konden worden: 1) lactose-sulfiet medium (ISO 7937) en 2) lactose-gelatine medium en beweeglijkheid-nitraat medium (facultatief in EN 13401). De prestatiekenmerken werden berekend volgens zowel ISO 5725 (1994) als volgens prEN ISO 16140 (2000). De herhaarbaarheid (r) en reproduceerbaarheid (R) werden voor elk monster type, concentratieniveau en bevestigingsmethode afzonderlijk berekend. De precisie varieerde per monstertype. De analyse van de RMs leverde de beste prestatiekenmerken op<br>

Het Communautair Referentie Laboratorium voor Salmonella (CRL-Salmonella, Bilthoven, Nederland) organiseerde in 2002 een zesde bacteriologisch ringonderzoek. Zeventien Nationale Referentie Laboratoria voor Salmonella (NRLs-Salmonella) namen deel aan deze studie. Referentie materialen in combinatie met of zonder de aanwezigheid van kippenfeces, zowel als natuurlijk besmette feces monsters (bevattende Salmonella Infantis) werden getest door alle laboratoria. De referentie materialen bestonden uit gelatine capsules met verschillende besmettingsniveaus Salmonella Typhimurium (STM), Salmonella Enteritidis (SE) of Salmonella Panama (SPan). Bovendien werd naast de uitvoering van de testen van de laboratoria een vergelijking gemaakt tussen de media zoals beschreven in de nieuwe ISO 6579:2002 [Rappaport Vassiliadis Soya Broth (RVS), Mueller Kauffmann Tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn) and Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD)] en de alternatieve media Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV) en Briljant Groen Agar (BGA). Significant meer positieve isolaties werden gevonden met capsules welke STM bevatten dan met capsules welke SE bevatten, onafhankelijk van het besmettingsniveau of methode. De totale resultaten van alle verschillende capsules zowel als de resultaten van de natuurlijk besmette monsters lieten betere resultaten zien voor MSRV (met BGA en XLD als uitplaat-medium) in vergelijking met de ISO 6579:2002 methode.<br>

In 2002 werden haalbaarheid certificeringsringonderzoeken georganiseerd met drie verschillende typen microbiologische referentiematerialen voor acht verschillende ISO en EN standaard methoden, gerelateerd aan EU water wetgeving (Drinkwaterrichtlijn en Zwemwaterrichtlijn). De studies werden uitgevoerd in het kader van het Europese project: 'Microbiologische gecertificeerde referentiematerialen ter ondersteuning van EU water wetgeving, testen van performance en laboratorium kwaliteitscontrole' (MICROCRM 01/02/2001 - 01/11/2003). De doelstelling van het MICROCRM project was om de condities te bepalen welke nodig zijn voor de productie en certificering van belangrijke referentiematerialen voor watermicrobiologie. De drie verschillende typen referentiematerialen waren capsules, lenticules en pastilles. Voor ieder type referentiemateriaal werden acht partijen, met verschillende stammen, bereid (om te gebruiken met de acht verschillende methoden). Dertien Europese laboratoria namen deel aan de studies. De resultaten van de studies werden statistisch geanalyseerd door drie statistici van de drie partners in het project. De belangrijkste conclusie was dat certificering van de microbiologische referentiematerialen haalbaar was voor alle tot doel gestelde parameters op de gewenste besmettingsniveaus voor de richtlijnen zoals hierboven vermeld.

Ten behoeve van het Europese project 'MICROCRM' werden partijen microbiologische referentiematerialen (RMs) bereid voor het uitvoeren van haalbaarheid certificeringsstudies. De drie partners in het project, Instituut Pasteur (Lille, Fr), Public Health Laboratory Services (Newcastle, UK) en het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (Bilthoven, NL), produceerden elk partijen van 55n van drie verschillende typen microbiologische RMs (pastilles, lenticules of capsules). Bij het RIVM werden vier partijen capsule RMs bereid, elk met een verschillende stam. Iedere partij werd gecontroleerd op homogeniteit, lange termijn stabiliteit bij opslagtemperatuur (-20 graden C) en korte termijn stabiliteit bij verhoogde temperaturen (5 graden C, 22 graden C, 30 graden C en 36 graden C). De partij RMs met Escherichia coli werd geanalyseerd met 2 verschillende kweekmethoden. De partij RMs met Enterococcus faecium werd geanalyseerd met 4 verschillende kweekmethoden. De partijen RMs met Clostridium perfringens en Pseudomonas aeruginosa werden ieder geanalyseerd met 1 kweekmethode. De partij RMs met P. aeruginosa was weinig stabiel bij opslagtemperatuur (-20 graden C) en er werd besloten om deze partij niet te gebruiken voor de haalbaarheid certificeringsstudies. De kwaliteit van de andere partijen capsule RMs was voldoende om te gebruiken in verdere studies.<br>

In 2003 werd door het Communautair Referentie Laboratorium voor Salmonella (CRL-Salmonella, Bilthoven, the Netherlands) het zevende bacteriologische ringonderzoek georganiseerd. Nationale Referentie Laboratoria voor Salmonella (NRL's-Salmonella) van de EU lidstaten (16), van NRL Noorwegen en van drie EU kandidaat lidstaten namen deel aan deze studie. Referentiematerialen in combinatie met of zonder de aanwezigheid van kippenfeces, zowel als natuurlijk besmette feces (bevattende Salmonella Muenchen) werden getest. De referentiematerialen bestonden uit gelatine capsules met verschillende besmettingsniveaus van Salmonella Typhimurium (STM), Salmonella Enteritidis (SE) of Salmonella Panama (SPan). Bovendien werd naast de uitvoering van de testen door de laboratoria een vergelijking gemaakt tussen de media zoals beschreven in ISO 6579: 2002 en de alternatieve media Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV) en Briljant Groen Agar (BGA), resulterend in zes medium combinaties. Significant meer positieve isolaties werden gevonden met capsules welke een hoog gehalte aan SE bevatten en in afnemende volgorde, met een laag gehalte aan SE en een hoog gehalte aan STM en vervolgens met een laag gehalte aan STM. De totale resultaten van zowel alle capsules als van de natuurlijk besmette monsters lieten betere (alhoewel niet statistisch significant) resultaten zien voor MSRV (met BGA en XLD als uitplaat-medium) in vergelijking met de ISO 6579: 2002 methode. Zeven laboratoria scoorden systematisch onder de gemiddelde resultaten behaald door alle laboratoria met de kunstmatig besmette monsters voor alle zes medium combinaties en negen laboratoria met de natuurlijk besmette monsters.